Sekvenování DNA
Sekvenování DNA je souhrnné označení biochemických metod, které umožňují popsat sekvenci nukleotidů v určitém úseku DNA a pomocí kterých lze zjistit i pořadí nukleových bází (A, C, G, T) v řetězcích DNA. Tyto řetězce jsou součástí dědičné informace v jádru, plazmidech, plastidech a v mitochondriích.
Související nemoci
Dnes jsou v praxi používány zejména dvě metody založené na replikaci DNA. Jedná se o starší Sangerovu sekvenaci a novější, principiálně složitější sekvenování nové generace (Next Generation Sequencing - NGS).
Metody sekvenování DNA
Dvěma základními sekvenačními metodami je Maxamovo-Gilbertovo sekvenování a Sangerovo sekvenování. I když je dnes známo již ohromné množství metod sekvenování DNA, Sangerova metoda je i tak používána stále od sedmdesátých let 20. století až dosud. Metoda Fredericka Sangera je založena na použití dideoxynukleotidů a následné elektroforézy.
Sangerovo sekvenování je primárně využíváno při nutnosti sekvenování malého množství krátkých vzorků, ale při sekvenování většího množství jsou jeho výhody většinou překonány možnostmi NGS. Obě mají společné to, že k roztřídění sekvencí využívají gelovou elektroforézu, ale liší ve způsobu vzniku těchto sekvencí.
Maxamova–Gilbertova metoda
Metoda vyvinutá Allanem Maxamem a Walterem Gilbertem, je označována jako M&G nebo také jako „chemické sekvenování“. Vzorek obsahuje krátkou jednovláknovou nebo dvouvláknovou sekvenci DNA. V klasickém případě se dá tento vzorek rozdělí na pět částí a každá se pak vystaví chemikáliím, které specificky štěpí sekvenci DNA v místě, kde je identifikována určitá nukleová báze. První z pěti nádob obsahuje dimethylsulfát a piperidin, načež se zahřátím rozštěpí sekvence v místě, kde se nachází guanin.Obsahem druhé nádoby je hydrazin a piperidin a těmito chemikáliemi se DNA zase rozštěpí v místech přítomnosti cytosinu nebo thyminu. Tímto způsobem se v každé z pěti nádob docílí různě dlouhých sekvencí DNA.
Sangerova metoda
Sangerova metoda označovaná i jako „metoda plus a minus“, „dideoxy metoda“ nebo jako „metoda primed synthesis“ je využitelná k sekvenaci krátké sekvence jednovláknové DNA, která v podstatě využívá biologického procesu replikace DNA. Zvolená sekvence se vloží do reakční směsi obsahující nějaký vhodný radioaktivně označený primer, kterým je nejčastěji jeden ze čtyř dideoxynukleotidů. Dideoxynukleotid je totiž schopen začlenit se do právě se replikující DNA, avšak následně přeruší elongaci řetězce, neboť nemá skupinu OH, na kterou by se mohl přichytit další nukleotid. Každý dideoxynukleotid se vloží do jedné ze čtyř nádob se vzorkem a veškeré replikované sekvence v dané nádobě samozřejmě skončí dideoxynukleotidem svého druhu.
Konečným výsledkem je vytvoření směsi různě dlouhých sekvencí DNA, jenž začínají radioaktivním primerem a končí daným dideoxynukleotidem.
Pyrosekvenování
Pyrosekvenování (anglicky pyrosequencing) je jednou z novějších metod sekvenování DNA. Podobně Sangerova metoda se sice také zakládá na syntéze nových sekvencí DNA, avšak liší se způsobem začlenění daného nukleotidu a nevyžaduje žádnou elektroforézu. Ve směsi určené pro pyrosekvenování musí být přítomno značné množství enzymů. Kromě DNA polymerázy ještě i ATP sulfuryláza, luciferáza, apyráza a substráty adenosinfosfosulfát a luciferin. Do této směsi se postupně vkládají nukleotidy různých druhů (dATP, dGTP, dCTP, dTTP). Pokud po přidání jednoho z nich dojde k uvolnění světelného záření, pak to znamená, že se do vznikajícího řetězce zařadil jeden nebo i více nukleotidů tohoto typu. Vznik světelného záření je způsobeno enzymatickou reakcí, na jejímž začátku se uvolní pyrofosfát z nově začleněného nukleotidu a na jejímž konci je spotřeba luciferázou vzniklého ATP určeného k oxidaci luciferinu.
Nejnovější metody
Neustále dochází k objevování zcela nových metod označovaných anglickým termínem NGS (next-generation sequencing), jenž slibují zefektivnit, zjednodušit, urychlit a upřesnit sekvenování DNA, aby se dalo co nejrychleji přečíst velké genomy.
Sekvence získané sekvenováním nejnovějšími metodami (NGS) bývají obvykle velmi rozsáhlé soubory, které obsahují velké množství různých párů bází. Pro kontrolu kvality získaných sekvencí je obvykle používán program, jenž kontroluje kvalitu sekvencí. Jedním z nich je např. program FastQC.
Autor: Lenka Klabochová
