Genetická daktyloskopie

homepage

Genetická daktyloskopie (anglicky DNA fingerprinting) je sada metod forenzní chemie. Tyto metody jsou založeny na unikátnosti sekvence DNA, díky které lze spolehlivě určit totožnost osob, a zjistit, zda daný úsek DNA náleží hledanému člověku.

Tato metoda individuální identifikace se v dnešní době široce využívá v trestních případech - forenzní genetika, a v občanskoprávních sporech, a to hlavně v souvislosti s určováním rodičovství - paternitní spory. V obou případech často slouží výsledky DNA fingerprintingu jako hlavní důkazní materiál.

Velké množství našeho genomu se sdílí nejenom se všemi ostatními lidmi, ale do značné míry také se šimpanzi.

Jedinečnost každého z nás potvrdil v roce 1985 na Leicesterské univerzitě tým kolem Aleca Jeffreyse. Zjistili, že určitá místa DNA podléhají polymorfismu, a na základě tohoto objevu vymyslel Jeffreys postupy k izolování metody na analýzu a izolaci těchto částí lidské DNA. Z tohoto důvodu je v současnosti pro genetickou daktyloskopii nejčastěji využíván právě polymorfismus v repetitivní DNA, zejména krátké tandemové repetice, která se odlišuje množstvím svých opakování, a tudíž svou délkou.

Metody genetické daktyloskopie

Analýzu DNA je možné provést v podstatě z každého typu lidské tkáně a také ze zdrojů na DNA poměrně chudých - z nehtů, kostí, šupinek kůže, konečků vlasů atd.  Analytických metod, které jsou používány při porovnávání  vzorků DNA, je celá řada a často se jejich použití kombinuje a prolíná.

Nejpoužívanějšími metodami jsou: 

1) Polymerázová řetězová reakce

Polymerázová řetězová reakce (PCR) je určena k vytvoření mnoha milionů přesných kopií vzorové části DNA, která má maximální délku 10 tisíc nukleotidů. To dává možnost provést analýzu DNA také z velmi malého vzorku.

2) Random-amplified polymorphic DNA

Random-amplified polymorphic DNA (RAPD) je méně přesnou metodou, která se pro svou rychlost a nenáročnost občas používá jako předost.

3) Short Tandem Repeat Polymorphism a Variable Number Tandem Repeats

Short Tandem Repeat Polymorphism (STRP) a Variable Number Tandem Repeats (VNTR ) jsou v dnešní době nejpoužívanější moderní metody. 99 % DNA je společná pro všechny lidi. V DNA se však nachází místa, která ke kódování genů neslouží, a která jsou vytvářena opakováním krátkého motivu - nějakého „slova“, které je tvořeno mnohokrát opakovaným sledem 2 - 4 nukleotidů - např. -CACG-CACG-CACG-. Nazýváme je tandemové repetice a v lidské DNA je jich nám známo více než 8 tisíc. Délka těchto repetic a jejich podoba je výrazně individuální, což je způsobeno jejich mutací, které nemají pro člověka zřejmě žádný význam, protože nekódují žádnou genetickou informaci. Ale jestliže by mutace postihla nějaký esenciální gen, pak by asi podstatným způsobem poškodila správnou činnost genu a nejspíš i zabránila přežití takového jedince, což velmi účinně odstraňuje podobné nesrovnalosti ze společnosti. Při testování se postupem, který je použitý při RFLP, určí, jak je zvolená tandemová repetice u daného člověka dlouhá, což znamená, kolika opakováními „slova“ je vytvořena. A stejně se postupuje také u dalších repetic - celkem je jich většinou zkoumáno 15, jestliže není zapotřebí vyšší počet. Správnost výsledků této metody je stejně jako u RFLP blízká 100%.

4) Restriction Fragment Length Polymorphism

Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) je klasická metoda určování genetického profilu, která dnes není tak často používána, jako dříve.

Příprava vzorku

1) Extrakce DNA

Molekula DNA se musí nejprve izolovat z buňky a očistit od všech případných nečistot, jako jsou např. bílkoviny, fenoly a agarosa. K extrakci a očištění DNA se používá guanidinhydrochlorid, ale nejdříve musí být provedena izolace jader za pomoci centrifugace. Přezkoumání čistoty vzorku se měří spektrofotometrickým měřenín v UV světle. U menšího vzorku, nebo větším množství nečistot lze určit přesněji koncentraci nukleové kyseliny z intenzity fluorescence vydávané ethidiumbromidem.

2) Štípání a amplifikace DNA

Dalším krokem po extrahování vzorku DNA je rozštěpení molekuly na malé jednotlivé fragmenty. Dnes známe přibližně 1500 restrikčních endonukleáz, které dovedou rozeznat krátké sekvence nukleotidů - 4, 6, 8 a podle rozpoznané sekvence zvládnou DNA v konkrétním místě rozštěpit. Jejich použití pak způsobí fragmentaci DNA na díly, specifické pro každého člověka, protože přesné pořadí bází je u každého člověka kromě jednovaječných dvojčat jiné. Výsledkem je poté směs různě velkých úseků DNA.

3) Separace fragmentů elektroforeticky

Když už je DNA řádně rozštípaná a v dostatečném množství, musí se jednotlivé úseky DNA od sebe oddělit, přičemž je k tomuto účelu nejčastěji používána gelová elektroforéza na agaróze. Směs se pak nalije k jednomu konci nádoby, který má tenkou vrstvu speciálního agarosního gelu. Jelikož má DNA záporný náboj, tak postupuje v gelu k anodě (+). Ale poněvadž různě velké kusy DNA postupují různou rychlostí, tak se jednotlivé fragmenty DNA rozdělí do tzv. DNA profilu.

4) Přesun fragmentů na nylonovou membránu

Ale protože se s agarosovým gelem špatně pracuje, je DNA přenášena na nylonovou membránu. Tento proces se nazývá Southern blot. Předtím se však musí DNA rozdělit na jednotlivá vlákna, což se dělá pomocí hydroxidu sodného. Pak se na gel přiloží nylonová membrána, která z gelu vysaje rozpouštědlo. Společně s rozpouštědlem se pohybují také fragmenty DNA, které se zachytí na membráně. Na závěr se nylonová membrána ozáří paprsky UV, díky kterým se fragmenty na membráně umístí natrvalo.

5) Přidání hybridizačních sond

Pak se na membránu nalije roztok s hybridizačními sondami – a to buď fluorescenčně, nebo radioaktivně značenými krátkými kousky DNA, které se následně spojí s DNA na membráně. Pomocí detergentů, nebo neionizovaného formamidu se zamezí vazbě sondy na nylon.

6) Vizualizace a identifikace

Na membránu se umístí X-ray film. Sondy, rozmístěné jen v některých částech membrány, způsobí expozici filmu v náležitých částech. Film je tak vyvolán, čímž vznikne DNA fingerprint, sestavený složený z proužků různých rozestupů a různé tloušťky. Tato metoda je nazývána „Southern blot“ podle vynálezce Edwina Southerna.